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文章解读 | 肿瘤细胞通过死亡受体6诱导内皮细胞程序性死亡来促进转移

TumorDecoder2018-01-11 19:01:46


文章题目:Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis

研究人员:来自德国多个机构的联合研究团队

发表时间:2016.07

期刊名称:Nature

影响因子:40.137


研究背景

死亡受体6(DR6)也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员21(TNFRSF21),是肿瘤坏死因子受体超家族细胞表面的受体,其激活JNK和NF-κB通路将凋亡信号传递到细胞内部。众所周知,癌细胞转移是人类癌症致死的主要原因。癌细胞转移是一个复杂的多步过程,转移过程中,单独的肿瘤细胞主要通过循环系统在距离原肿瘤较远的器官定居。肿瘤细胞一旦进入循环系统就处于一种易受攻击的状态,因而它们的转移能力很大程度上依赖于一种快速并且有效率的穿过内皮屏障来逃离血流的方式。有证据表明,肿瘤细胞外渗采取一种类似于白细胞跨内皮迁移的方式。然而肿瘤细胞在渗出过程中与内皮细胞的相互作用方式以及相关的分子调控机理仍未被阐明。该研究显示,人和小鼠的肿瘤细胞可通过诱导内皮细胞程序性坏死(坏死性凋亡)来促进肿瘤细胞渗出和转移。在小鼠模型中,采用受体结合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1, RIPK1)抑制剂坏死稳定素1 (necrostatin-1)或内皮细胞特异性敲除RIPK3的疗法能够降低肿瘤细胞介导的内皮坏死,导致肿瘤细胞的外渗和转移。而药理学的细胞凋亡蛋白酶抑制或者细胞凋亡蛋白酶-8的内皮细胞特异性敲除能促进这些过程。体内、体外实验结果进一步显示:肿瘤细胞介导的内皮坏死导致的外渗和转移需要肿瘤细胞自身表达的淀粉样前蛋白(amyloid precursor protein;APP)和内皮细胞表达的淀粉样前蛋白受体死亡受体6(death receptor 6, DR6)作为这些结果的主要介导因子。本项研究数据确定了一种肿瘤细胞浸出和转移的新机制,并且暗示着内皮DR6介导的坏死信号通路可以成为抗转移疗法的靶点。


研究成果

图1. TC诱导的内皮坏死促进TC跨内皮迁移

  1. 图1a描述在TCs(绿色)存在的情况下培养的人脐静脉ECs(HUVEC)的荧光图像。在研究肿瘤细胞(TCs)和内皮细胞(ECs)相互作用时,研究人员发现当与TCs共培养时ECs死亡的数目增加(如图1a)。在星形胶质细胞瘤或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理后,凋亡的ECs无凋亡特征(如核浓缩和/或碎裂以及凋亡的ECs)。相反,ECs的细胞核暴露在TCs上并显示出形态学上的微小变化类似于接受H2O2或缺氧诱导的坏死细胞的细胞核,但阳性乙锭-同型二聚体-III(EthD-III)处理后(图1a箭头指阳性EthD-III),显示坏死细胞的膜完整性受损(图1a)。 

  2. TCs诱导坏死性ECs死亡且不受外周血单核细胞和血小板的影响,在不同原代的人和小鼠的ECs中以浓度依赖性的方式获得多种TCs(图1b)。EthD-III阳性的ECs与磷酸-MLKL共染,并且在ECs敲除RIPK3或MLKL后用RIPK1激酶抑制剂necrostatin-1(Nec-1)阻止TC-诱导内皮坏死细胞的死亡来进行细胞治疗(图1c)。 相反,通过用z-VAD-fmk(zVAD)处理细胞来抑制半胱天冬酶,结果显示ECs的坏死数量增加(图1c,d)。

以上这些数据确定了TC诱导的EC死亡的模式为程序性死亡。有趣的是,抑制TC诱导程序性死亡减少了EC层上的TC迁移,而增强的程序性死亡促进了TC的迁移(图1e,f)。

图2. TC诱导的EC坏死和转移需要内皮细胞RIPK3

  1. 几个小时后在静脉注射同源的B16F10(B16)黑素瘤或LLC1(Lewis lung carcinoma line 1)细胞到C57BL/6野生型(WT)小鼠。这些动物的肺显示出EthD-III阳性细胞,随后将他们共染到EC标记物ERG和CD31上(图2b),但仍有没有显示出荧光标记的TC或CD45阳性白细胞的任何重叠的细胞(图2a)。 

  2. EthD-III阳性的ECs没有显示染色质浓缩或碎裂的迹象(图2a),并且对于caspase-3,TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)或膜联蛋白-V均是阴性的(图2a)。

  3. TC诱导的EC坏死不是由于物理血管闭塞造成,因为它没有进行等量的15um微球体重复静脉注射。在具有tamoxifen诱导内皮细胞特异性缺陷RIPK3且肺血管通透性正常的小鼠中,TC注入后EthD-III阳性的EC数量减少(图2c,d)。此外,来自这些基因敲除动物的EC上转移的TC数量在体外减少,并且静脉注射6小时后内皮细胞RIPK3表达的丧失使得TCs的外渗数目大大减少。 

  4. TC注射以及12天后的转移数目(图2e-g)均来自原发性肿瘤的转移。在MLKL缺陷小鼠中观察到类似的作用,在用Nec-1短期处理WT小鼠之后,发现并不影响其TC增殖,存活能力或体外迁移(图2h-k)。

  5. 当将人MDA-MB-231TCs注射到免疫缺陷的SCID小鼠中时,Nec-1也降低了使得小鼠TC的转移量降低,并且Nec-1治疗导致ECs坏死和转移量降低。相反,具有正常肺血管通透性和诱导EC特异性caspase-8缺陷的动物用zVAD治疗显示出EthD-III阳性,ECs的数量增加和TCs外渗。因此,TC也在体内诱导坏死性EC死亡,并且EC坏死促进TC的外渗和转移形成。

图3. DR6介导TC诱导的内皮细胞坏死和转移形成

  1. 为了鉴定介导TC诱导程序性死亡的内皮细胞受体,研究人员进行了32个候选基因的短干扰RNA(siRNA)介导的敲除。发现敲除在EC中的DR6,减少了TC诱导程序性死亡和跨内皮的TC迁移(图3a-c)。 

  2. TNF受体家族成员DR6在小鼠和人体内是由不同血管床的ECs表达组成的,并含有能够使细胞死亡信号传导的胞质死亡结构域。缺乏DR6的小鼠表现出转移减少(如图3d),并且由免疫细胞表达的DR6不参与转移。

  3. 通过抗DR6抗体抑制DR6功能,保护ECs免于TC诱导的程序性死亡,大大减少了TCs在内皮层上迁移的数量。用抗DR6抗体在TC注射后6小时内处理的动物显示程序性死亡的EC和外渗的TC数目减少,并且这些动物发生较少的转移(图3e-j)。因为DR6胞外域融合Fc片段抑制TCs诱导内皮细胞的坏死,TC跨内皮迁移以及迁移的发展(图3ej)所以这些DR6介导作用的实现需要配体与DR6结合。

图4. TC表达的APP诱导内皮细胞坏死并促进转移

  1. 先前鉴定的DR6配体是在各种TCs中广泛表达的淀粉样前体蛋白(APP)。 在TCs中APP表达的敲除大大地降低了它们诱导内皮程序性死亡和EC单层细胞转移的能力(图4a,b)。TC-EC共培养的条件介导纯化可溶性的APPsα片段或细胞转染来构建过度表达的APPsα-诱导内皮细胞坏死(图4c)。然而,这种过表达的EC细胞直接接触程序性死亡的APP跨膜全长形式(图4d)。因此,TNF受体家族的配体诱导细胞死亡的功效与以其跨膜形式存在时增加的观点一致。

  2. 通过SiRNA介导敲除大大降低了TCs中APP的表达,显示出正常的增殖细胞存活和基本迁移活动但是主要的肺表层ECs迁移能力下降。此外,这些TCs几乎完全丧失能力后通过静脉注射来诱导EC细胞程序性死亡、外渗、转移和形成转移灶(图4e-i)。有趣的是,流行病学资料显示TC中APP高表达与转移灶较高形成频率和预后不良有关。


研究讨论

内皮细胞程序性死亡如何促进转移的形成?可以想象,死亡的ECs提供给TCs可以通过和外渗的缺口。 从裂解的坏死细胞释放的与损伤相关分子模式(DAMP)的分子也可能作用于TC、相邻的EC或其他细胞,从而促进TCs外渗和转移。与坏死或程序性死亡细胞相关的DAMP分子是ATP,其显示出对TC具有迁徙作用并诱导内皮屏障的开放来促进TC转移。研究数据显示:TCs通过APP和DR6诱导内皮细胞程序性死亡,这是TCs有效地外渗和转移所必需的。由于在生理条件下坏死或程序性死亡是罕见存在的,所以在肿瘤进展的背景下针对DR6介导的ECs的程序性死亡可能代表了预防或治疗肿瘤转移的新方法。


样本与方法

样本采集:

从Zyagen获得冷冻的人组织样品。按照黑森州地区医学地方伦理委员会的规定进行人体样本的实验,并获得所有项目的知情同意书。

研究方法

1. 细胞死亡测定:

  1. 将人脐静脉血管上皮细胞(HUVECs),人肺微血管静脉内皮细胞(HMVECs-L)或L929细胞在96孔板中培养24小时。使用rhTRAIL、rhTNF-α 、Staurosporine、H2O2、rmTNF-α 过夜刺激或在低氧条件下培养来诱导细胞死亡。

  2. 共培养实验,将含有20倍血小板的钙黄绿素-AM染色后的PBMC单独加入到有1.5×103个表达绿色荧光蛋白(GFP)的肿瘤细胞(TCs)、钙黄绿素-AM-标记的TCs、COS-1/HEK293T细胞、新鲜的人外周血单核细胞(PBMC)中,或者在存在指定物质的情况下:将Nec-1 (30 μ M)、z-VAD-fmk (100 μ M)、etanercept (20 μ g/ml)、DR6-Fc 或 IgG1-Fc (0.1–1 μ g/ml)、抗DR6 (5D10) 或IgG1同种型对照抗体(1 -30μg/ ml)加入到血管内皮细胞(ECs)单层中培养过夜。并用Ficoll密度梯度离心的标准方法分离PBMC。

  3. 上清液实验,在TCs存在的条件下使用共培养的HUVEC条件培养基培养18小时,让HUVEC单层细胞生长至融合状态。

  4. 敲除实验,使用不同组的siRNA Lipofectamine RNAiMAX转染1.5x104个HUVECs并在96孔板上培养。在TCs上进行siRNA介导的敲除实验,使用不同组的siRNA Lipofectamine RNAiMAX转染细胞并在内皮细胞单层融合转染后接种48小时。

  5. 当laemmli缓冲液溶解的时候通过western blot或定量RT-PCR确定敲除率。对Hoechst 33342-阳性细胞计数或使用Nec-1/zVAD处理来测定基因敲除后的TC值;计数浓缩和/或EthD-III阳性细胞核来测定TC死亡;通过划痕检测来确定细胞是否迁移。

注:HUVEC和MDA-MB-231-GFP TC均用于体外研究,除非另有说明

2. 细胞死亡分析:

  1. 对于所有条件,在自动图像采集之前,将EthD-III(1.6μM,Biotium;不可渗透细胞膜的核染料)和Hoechst 33342(可渗透细胞膜的核染料)少量加入到使用Olympus IX81显微镜的控制室(37℃,5%CO2)。

  2. 与活细胞相比,选择已经确定凋亡,坏死或程序性死亡的细胞进行细胞培养,并使用Hoechst 33342和EthD-III染色。从死细胞中鉴别凋亡的形态学标准被定义如下:一个活细胞有一个正常的圆肾形核且EthD-III显阴性。凋亡细胞具有强烈的核收缩,细胞核呈破碎状态且对于EthD-III显阴性。坏死/程序性死亡的细胞具有正常的圆肾形核或小程度的核收缩(不缩合也不碎裂),并且对EthD-III呈阳性。晚期凋亡细胞对于EthD-III是阳性的,但可以根据其核的强收缩和破碎状况与坏死/程序性死亡细胞区分。

  3. 为了防止对凋亡细胞核碎片重复计数,将半径为三个像素的高斯模糊应用于有待分析的图像。通过低阈值(TH1)确定所有内皮细胞核的总数,并绘出所有Hoechst 33342染色是阳性细胞核的折线图。在可能的情况下,使用第二个单独的阈值(TH2)来确定缩合细胞核的数量。所有图像在ImageJ(美国国立卫生研究院)进行分析。

注:     1.EC被定义为GFP-或钙黄绿素-AM-阴性细胞。

            2.除非另有说明,每个实验至少进行三次,每个条件最少6个孔,每个孔获得4个独立的图像。

3. Transwell分析

  1. 如前所述进行测定,将ECs(在50μl接种时为1.5×10 4)培养2天。

  2. 敲除实验,使用不同组的siRNA Lipofectamine RNAiMAX转染8x103个HUVECs,在具有8μm孔径聚酯膜(Corning)的96孔板上培养,每天更换培养基直至达到融合。 

  3. transmigration experiments(迁移实验),去除上层隔室的培养基,并在50μl内皮细胞培养基/不同物质的存在下加入7.5×103GFP-或钙黄绿素-AM-标记的TCs。 

  4. 所有的实验,在过滤器下对迁移(transmigration)的TCs成像并用ImageJ定量。 

注:每个实验至少进行三次,每个条件最少6个孔。

4. 转移模型

  1. 将50μlPBS中未标记的TCs或用CFSE标记的TCs或荧光微球(直径15μm)注射到小鼠的侧尾静脉,根据小鼠体重每克1600TCs或微球注射。

  2. 抑制实验,将两种剂量的25μlNec-1(1.65μg/ g),Nec-1s(1.65μg/ g),z-VAD(OMe)-fmk(4μg/ g),etanercept(10mg / kg),rmDR6-Fc(0.2μg/ g),rmIgG2A-Fc(0.2μg/ g),抗DR6(3.5μg/ g)在注射TCs前后3小时注入小鼠尾静脉。

  3. 评估TC诱导EC的死亡情况,在注射TCs 6小时后,静脉注射50μl EthD-III。10分钟后将动物杀死并用PBS和4%多聚甲醛灌注,直接进行免疫组化分析。

  4. 评估外渗TCs的量,将CFSE-标记的B16 TC注射到静脉内。6小时后分离未灌注的肺,并用4%多聚甲醛固定。在Leica SP5共焦显微镜的xyz视图中分析染色的冷冻切片。通过手动计数EthD-III/ERG-或EthD-III/CD31-双阳性细胞来确定EthD-III阳性ECs的数目。

  5. 定量外渗的TCs,根据两个标准来分析冷冻切片:TCs直接被CD31染色(即血管)包围并且具有非侵入性表型(即圆形细胞),它被认为是血管内的;血液外的细胞是具有侵入性表型的血管(即,具有突起的不规则细胞),它被认为是血管外的。对于这两种分析,将来自一个肺的每个切片的EthD-III阳性ECs或外渗TCs的数量求平均值(每只小鼠的平均数),并且从一个实验中将这些值再次求平均以获得最终平均值±s.e.m.或±s.d.。

  6. 评价肺转移,在TCs 静脉注射6小时后采用上述物质的第三种治疗方式(荧光微球注射到小鼠的侧尾静脉),12天后在宏观和微观条件下通过以每十分之一为单位分析全肺切片和H&E染色后的肺转移状况。

  7. 研究原发性肿瘤转移的形成,将25μlPBS中的1×106B16或LLC1TCs皮下注射到小鼠的侧腹,并在10天后对其进行切除原发性肿瘤的手术,然后通过显微镜对肺转移进行分析。

注:     1.肺转移的平均数通过在同一实验中对每个个体肺转移的平均值±s.d.或±s.e.m.来确定。

          2.每组使用最少三只动物,动物组是性别匹配的,小鼠是8-16周龄并对小鼠的基因型进行盲试验。

5. 小鼠

  1. 为了得到RIPK3条件性敲除动物,将来自Ripk3含有长度为880bp的loxP侧翼外显子2和3以及来自BAC RPCI-23-237G18扩增的5'同源臂和3'同源臂克隆到含有Frt侧翼新霉素抗性基因(neoR)和白喉毒素A基因(dta)中,并作为阴性选择标记的pKOII靶向载体。靶向载体采用NotI线性化并通过电穿孔导入V6.5 ES细胞中。

  2. 用400μg/ml G418处理后分离克隆的DNA,并通过Southern印迹筛选正确的重组。将两个独立的ES细胞克隆并注射到C57BL/6胚泡中,随后将其转移到假孕雌体中并用该小鼠繁殖雄性嵌合体来产生杂合体。然后将小鼠与Flp-敲除小鼠杂交以除去新霉素盒(neomycin cassette),随后与Tie2-CreERT2动物杂交来获得Tie2-CreERT2; RIPK3loxP/loxP。使用引物RIPK3-fl_fwd和RIPK3-fl_rev,通过loxP-PCR反应检测WT等位基因(+)和floxed(fl)等位基因,分别得到295bp(WT)和340bp(fl)大小的条带。

  3. 为了诱导重组,对动物采用1mg/天的tamoxifen(Sigma)处理,这样连续5天,在7-9天后开始实验。通过western blot对基因敲除动物肺上的离体ECs和有Cre-阴性动物肺的ECs的蛋白质水平比较来确定在ECs上胱天蛋白酶-8和RIPK3基因被敲除。

  4. 使用Miles测定对体内渗透性定量。在tamoxifen诱导敲除后11天,小鼠接受尾静脉注射0.5% Evans blue染料。30分钟后处死小鼠,并在56℃下用甲酰胺从肺中洗脱外渗的蓝色染料,在620nm处进行光谱测量。肺细胞体外培养18小时后,静脉注射1ml星形孢菌素,其与用半胱天冬酶-3/膜联蛋白-V的抗体或者用TUNEL测定法进行染色做阳性对照。

  5. 为了产生MLKL-/-动物,使用TAL核苷酸靶向物设计靶向Mlk1基因的第二外显子的TALEN对。选择靶向ATG下游〜70bp且具有19bp间隔区的一对,通过Golden Gate TALEN和TAL效应器试剂盒2.0将NI NH NH HD克隆到RCIscript-GoldyTALEN中,用于随后的体外转录。使用RNA离心柱纯化mRNA,并以25或50ng/μl的浓度将其显微注射到小鼠的受精卵中。第二天将存活的胚胎转移到假孕卵中。通过PCR对T7核酸内切酶I进行测定来检测突变后代。采用western blot分析纯合MLKL突变小鼠的脾和肺上MLKL蛋白的表达。对于MLKL-/-动物的基因分型,使用type_rev引物与MLKL_TAL_wt 5'-ATGCCAGCGTCTAGGAAACC-3'或MLKL_TAL_mut 5'-GGAAACAATGCCAGCGTCAGT-3'组合分别获得245bp WT或244bp的敲除条带。

6. 鉴定参与调节TC诱导的EC死亡的内皮受体

  1. 使用来自HUVEC,HMVEC-L或小鼠肺ECs(MLEC)的cDNA对已知受体家族成员介导不同形式的程序性死亡来分析132个基因变异的表达水平。

  2. 使用标准方案进行RNA分离和cDNA转录并采用通用探针库技术进行定量PCR。当相应的cDNA的水平大于GAPDH的10-6倍时,认为基因被表达。

  3. 基于以下两个标准选择用于对基因的进一步筛选:首先,在三个测试的ECs中至少一个中高度表达; 然后,该基因在HUVEC中表达。最终得到44个基因可进行检测,以96孔对介导TCs诱导的ECs死亡的潜在受体进行筛选。

  4. 使用来自Sigma的siRNA转染的HUVEC来进行初始筛选(仅使用表达水平<25%的siRNA)。基因敲除(RIPK3)后且没有TCs培养的HUVEC与用短干扰siRNA转染的HUVEC进行比较(汇合度小于75%的单层细胞不包括在最终分析中)。最终的分析显示TCs诱导的ECs死亡的比例下降。

  5. 在基因沉默48小时后,在100μMz-VAD-fmk存在的条件下,将2x103个MDA-MB-231-GFPTCs接种在HUVEC的融合单层细胞上。过夜共培养后,如上所述测定死亡ECs的数目。该步骤五轮独立进行,每轮都有重复。每种条件下ECs坏死的比例被定义为与用短干扰siRNA转染的HUVEC相比。对于每个平板分别测定在小干扰siRNA转染的HUVEC中无TCs的细胞死亡值,并从每个值中减去。对于>1的值,基因敲除导致TCs诱导的内皮细胞坏死增加;对于值= 1,基因敲除导致没有变化;对于<1的值,基因敲除导致TCs诱导的内皮坏死症的减少。

7. 照射程序和骨髓移植

对8-10周龄的DR6+/+WT或DR6-/-小鼠进行8.5Gy的全身照射。通过用DMEM轻轻冲洗股骨和两个胫骨来获得骨髓细胞。 将细胞离心,重悬于HBSS(不含Mg2+或Ca2+)中并且静脉注射5x10 7个细胞(活力> 95%)100μl。移植后6周注射TCs,6h后测定ECs死亡和外渗TCs的数量,12天后测定表面转移的数目。

8. 生成APP表达细胞

  1. 为了产生稳定表达的HEK细胞,使用膜结合全长的huAPP695,使用一个经修饰的FUGW载体转染HEK293T,所述载体带有一个N-末端的myc-靶标,在泛素启动子控制下表达并选择嘌呤霉素抗性标记物。

  2. 为了产生表达膜结合全长形式的huAPP695或可溶性huAPP695-α片段的COS-1细胞,使用Lipofectamine 2000瞬时转染COS-1细胞(转染后24小时可用于后续分析)。为了检测APP,在CHAPS裂解缓冲液中对裂解细胞进行条件培养24小时,采用western blot对抗APP进一步处理,其中β-微管蛋白用作上样对照。 

注:pCAX APP695和pCAX APPs-695-α是D.Selkoe和T.Young-Pearse的赠品

9. 表达分析

  1. 得到6/96孔板各孔的细胞,根据制造商的方案分离RNA并转录成cDNA。每个反应取30ng的cDNA用Roche LightCycler480探针系统进行定量RT-PCR。引物使用罗氏公司提供的在线工具进行设计,并且只选择结果中的前三个引物对。

  2. 采取GAPDH标准化获得相对表达水平。对于单细胞基因表达分析,使用来自Fluidigm的mRNA Seq的96孔C1单细胞自动制备仪器进行RNA分离和cDNA合成。使用LightCycler480探针系统对内含子引物进行qRT-PCR。通过设定35个循环检测限值的方法来测定单个细胞的相对表达值,并且将值归一化到具有最高基因表达(100%)的细胞。

10. 统计分析

在所有的研究中,平均值的比较采用不成对的双尾Student's t-检验或单向/双向ANOVA和邦费罗尼校正。在所有分析中,统计学显著性在5%水平上(P<0.05)。使用Prism5、Prism6(GraphPad)或Excel(Microsoft)软件进行统计分析。


参考文献

[1] Boris Strilic, Lida Yang, et, al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis[J].Nature, 2016.

 

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